集(ji)菌(jun)儀 如何(he)用(yong)濾膜法(fa)測細(xi)菌(jun)總(zong)數

集(ji)菌(jun)儀 如何(he)用(yong)濾膜法(fa)測細(xi)菌(jun)總(zong)數

基於(yu)濾膜上(shang)細(xi)菌(jun)直接計數法(fa)的細(xi)菌(jun)總(zong)數快速檢(jian)測
【摘要】 細(xi)菌(jun)總(zong)數快速檢(jian)測在(zai)質(zhi)量監(jian)測中(zhong)具(ju)有重要的意(yi)義，目前(qian)除了經典的平(ping)板培(pei)養(yang)法以(yi)外(wai)，還有微菌(jun)落法、阻(zu)抗(kang)法(fa)等(deng)快速檢(jian)測方(fang)法，這些(xie)方(fang)法或者(zhe)需要較長(chang)的檢(jian)測時(shi)間(jian)，或者(zhe)需要較高(gao)的檢(jian)測成本。本研(yan)究提出(chu)壹種不需要培(pei)養(yang)而在(zai)濾膜上(shang)直接計數的細(xi)菌(jun)總(zong)數的快速檢(jian)測方(fang)法，它(ta)主要分為(wei)過(guo)濾、染(ran)色、顯(xian)微(wei)鏡(jing)計數和(he)計算(suan)四個步(bu)驟(zhou)。計算(suan)細(xi)菌(jun)總(zong)數時(shi)，根據細(xi)菌(jun)在(zai)濾膜上(shang)的分(fen)布(bu)特(te)點(dian)，對(dui)傳(chuan)統公(gong)式(shi)進行改進，提出(chu)按區域計算(suan)細(xi)菌(jun)總(zong)數的計算(suan)方(fang)法，提高(gao)了檢(jian)測精(jing)度(du)。研(yan)究結果(guo)表(biao)明(ming)，該方(fang)法與(yu)傳(chuan)統的平(ping)板培(pei)養(yang)法無顯(xian)著(zhu)性差異（t=0.847，P=0.436＞0.05），是(shi)壹種(zhong)低成本、快速的細(xi)菌(jun)總(zong)數檢(jian)測方(fang)法。
1 引 言
細(xi)菌(jun)總(zong)數計數的研(yan)究已有很(hen)多(duo)，目前(qian)國(guo)標(biao)規定(ding)的方(fang)法為(wei)平(ping)板計數法(fa)，該方(fang)法是將(jiang)樣品加入(ru)瓊脂營(ying)養(yang)基，在(zai)37 ℃下(xia)培(pei)養(yang)24～48 h後計數。這(zhe)種(zhong)方(fang)法精(jing)度(du)高，但耗時(shi)長，難(nan)以(yi)滿足實際(ji)工作需要。為(wei)了(le)簡化檢測程序(xu)、縮短(duan)檢(jian)測時(shi)間(jian)，國(guo)內(nei)外(wai)學者(zhe)進行了大(da)量的快速檢(jian)測方(fang)法的研(yan)究，提出(chu)了阻抗(kang)檢(jian)測法〔1〕、Simplate TM全平器計數法(fa)〔2〕、微(wei)菌(jun)落技(ji)術(shu)〔3-5〕、紙片(pian)法〔6-7〕等(deng)檢(jian)測方(fang)法，取得(de)了的成(cheng)果(guo)，但檢測時(shi)間(jian)仍在(zai)4 h以(yi)上(shang)。
本(ben)研(yan)究在(zai)分(fen)析了(le)已(yi)有研(yan)究成果(guo)的基礎上，提出(chu)了在(zai)濾膜上(shang)染(ran)色後，直接計數的細(xi)菌(jun)總(zong)數檢(jian)測方(fang)法，具體(ti)步驟(zhou)為(wei)：用(yong)集(ji)菌(jun)儀進行細(xi)菌(jun)收(shou)集(ji)→在(zai)膜(mo)上(shang)進行染(ran)色→在(zai)油(you)鏡(jing)下(xia)計數→按(an)公(gong)式(shi)計算(suan)出(chu)菌(jun)液濃度(du)。實驗(yan)結果(guo)表(biao)明(ming)，該方(fang)法與(yu)傳(chuan)統的平(ping)板培(pei)養(yang)法無顯(xian)著(zhu)性差異，檢(jian)測時(shi)間(jian)約1 h，是(shi)壹(yi)種快速的細(xi)菌(jun)總(zong)數檢(jian)測方(fang)法。
2 材料與(yu)方(fang)法
2.1 材料
本研(yan)究中(zhong)用(yong)的試驗(yan)材(cai)料有集(ji)菌(jun)儀（杭(hang)州泰林(lin)生(sheng)物技(ji)術(shu)設備(bei)有限(xian)公(gong)司），染(ran)色劑(ji)，生物(wu)顯(xian)微(wei)鏡(jing)（寧(ning)波(bo)永新光學股(gu)份(fen)有限(xian)公(gong)司），聚(ju)碳(tan)酸(suan)脂膜(mo)（直徑47 mm）。
2.2 實驗(yan)方(fang)法
2.2.1 準(zhun)備(bei)工作 卸(xie)下(xia)集(ji)菌(jun)儀的濾網(wang)（見(jian)圖1），統計濾網(wang)上(shang)小孔總(zong)數，為(wei)計算(suan)菌(jun)液濃度(du)做準(zhun)備(bei)。另外(wai)，還需對(dui)集(ji)菌(jun)儀中(zhong)的集(ji)菌(jun)器進行高壓(ya)滅(mie)菌(jun)，以(yi)防止過濾過程中(zhong)引入(ru)外(wai)源細(xi)菌(jun)。
2.2.2 細(xi)菌(jun)收(shou)集(ji) 取濃(nong)度的黴(mei)菌(jun)菌(jun)液300～500 ml，裝(zhuang)在(zai)集(ji)菌(jun)儀上，集(ji)菌(jun)儀采(cai)用(yong)蠕動加壓(ya)方(fang)式(shi)對(dui)菌(jun)液施加(jia)的壓(ya)力，使菌(jun)液流過(guo)孔徑為(wei)0.45 um的聚(ju)碳(tan)酸(suan)脂膜(mo)。采(cai)用(yong)過濾方(fang)法是因為(wei)它(ta)可(ke)以(yi)使細(xi)菌(jun)相對(dui)均(jun)勻地分(fen)布(bu)在(zai)濾膜上(shang)，而(er)選用(yong)聚碳(tan)酸(suan)脂膜(mo)是因(yin)為(wei)這(zhe)種膜(mo)具有良好(hao)的透(tou)光性，便於(yu)用(yong)顯(xian)微(wei)鏡(jing)觀(guan)察(cha)。
2.2.3 染(ran)色 集(ji)菌(jun)後取下(xia)濾膜，切(qie)下壹部分放(fang)在(zai)載(zai)玻(bo)片(pian)上(shang)，進行染(ran)色、固定(ding)。染(ran)色的目(mu)的是(shi)增大(da)細(xi)菌(jun)與(yu)背景的對(dui)比度(du)，便(bian)於(yu)觀察(cha)。
2.2.4 顯(xian)微(wei)鏡(jing)計數與(yu)計算(suan) 菌(jun)液經集(ji)菌(jun)儀過濾後，細(xi)菌(jun)在(zai)濾膜上(shang)的分(fen)布(bu)見(jian)圖2、圖3，由圖可(ke)以(yi)看(kan)出(chu)細(xi)菌(jun)分布(bu)具(ju)有以(yi)下(xia)兩(liang)個特(te)點(dian)：壹是(shi)細(xi)菌(jun)集(ji)中(zhong)在(zai)壹(yi)個個的圓(yuan)形區域內(nei)，這(zhe)些(xie)圓(yuan)形區域和(he)擋板的小(xiao)孔相對(dui)應；二(er)是(shi)各(ge)個圓(yuan)形區域之(zhi)間(jian)細(xi)菌(jun)很(hen)少(shao)。根據膜(mo)上細(xi)菌(jun)分布(bu)的這(zhe)種特點(dian)，提出(chu)以(yi)圓(yuan)形區域為(wei)單(dan)位(wei)進行計數，統計出(chu)圓(yuan)形區域內(nei)細(xi)菌(jun)的平(ping)均個數，從(cong)而(er)計算(suan)出(chu)菌(jun)液中(zhong)細(xi)菌(jun)總(zong)數。具(ju)體(ti)步驟(zhou)如(ru)下：隨(sui)機(ji)選(xuan)擇(ze)10個圓(yuan)形區域，在(zai)油(you)鏡(jing)下(xia)，調(tiao)節(jie)焦距(ju)以(yi)獲(huo)得(de)較(jiao)清晰(xi)的圖像（見(jian)圖4），統計每(mei)個圓(yuan)形區域內(nei)的細(xi)菌(jun)個數，然(ran)後按公(gong)式(shi)(1)計算(suan)出(chu)菌(jun)液的濃(nong)度。
X=A10×N/V(1)圖2 膜上細(xi)菌(jun)的區域分(fen)布(bu)
Fig 2 The distributing region of bacteria on the filter(100倍)
圖3 膜上細(xi)菌(jun)的區域間(jian)隔(ge)
Fig 3 The space among the distributing regions(100倍)
圖4 膜上細(xi)菌(jun)染(ran)色後圖像
Fig 4 Figure of bacteria after coloration(1 000倍)
式(shi)中(zhong)：X表(biao)示待(dai)檢菌(jun)液濃度(du)（CFU/ml）
A表(biao)示10個圓(yuan)形區域內(nei)細(xi)菌(jun)總(zong)數
N表(biao)示濾網(wang)上(shang)小孔總(zong)數
V表(biao)示集(ji)菌(jun)時(shi)所用(yong)待(dai)檢菌(jun)液體(ti)積（ml）
3 結果(guo)與(yu)討(tao)論(lun)
3.1 實驗(yan)結果(guo)
按上述方(fang)法計算(suan)得到的結果(guo)與(yu)平(ping)板培(pei)養(yang)法得到(dao)的結果(guo)見(jian)表(biao)1。表(biao)1 兩種(zhong)方(fang)法得到的細(xi)菌(jun)總(zong)數
Table 1 Total bacteria number by two different methods
樣(yang)本(ben)1樣(yang)本(ben)2樣本3樣(yang)本(ben)4樣(yang)本(ben)5樣本6染(ran)色鏡檢(jian)
(cfu/ml）185168157165171166平(ping)板培(pei)養(yang)
(cfu/ml)176155165158183152
對(dui)表(biao)1中(zhong)兩(liang)組數據進行配對(dui)t檢(jian)驗(yan)，在(zai)α=0.05時(shi)，雙尾(wei)檢驗(yan)結果(guo)如下：t=0.847，P=0.436＞0.05，說明(ming)兩種方(fang)法得到的結果(guo)無顯(xian)著(zhu)性差異。
3.2 討(tao)論(lun)
3.2.1 計算(suan)公(gong)式(shi)的改(gai)進 用(yong)集(ji)菌(jun)儀對(dui)樣(yang)本菌(jun)液進行過濾時(shi)，由於(yu)濾網(wang)擋(dang)板的作(zuo)用(yong)，使得細(xi)菌(jun)不是均勻地分(fen)布(bu)在(zai)整(zheng)個濾膜上(shang)，而(er)是集(ji)中(zhong)分(fen)布(bu)在(zai)濾網(wang)的小(xiao)孔處，所(suo)以(yi)，計算(suan)細(xi)菌(jun)總(zong)數時(shi)，不能采(cai)用(yong)公(gong)式(shi)X=A40×Φ1Φ22/V（其(qi)中(zhong)Φ1，Φ2分(fen)別(bie)為(wei)濾膜直徑和(he)視(shi)野直徑），該公(gong)式(shi)是微(wei)菌(jun)落方(fang)法檢測細(xi)菌(jun)總(zong)數中(zhong)的常(chang)用(yong)計算(suan)公(gong)式(shi)。在(zai)本(ben)實驗(yan)中(zhong)，根(gen)據細(xi)菌(jun)分布(bu)的特(te)點，提出(chu)以(yi)圓(yuan)形區域為(wei)單(dan)位(wei)計算(suan)細(xi)菌(jun)總(zong)數的思(si)路，使計算(suan)結果(guo)更接近(jin)真實值，從而提高(gao)了檢(jian)測精(jing)度(du)。
3.2.2 細(xi)菌(jun)大(da)小的影(ying)響 細(xi)菌(jun)大(da)小對(dui)本(ben)實驗(yan)的影(ying)響主要體(ti)現(xian)在(zai)鏡(jing)檢(jian)時(shi)，如果(guo)細(xi)菌(jun)太小，顯(xian)微(wei)鏡(jing)計數時(shi)不能將(jiang)細(xi)菌(jun)從背景中(zhong)分(fen)辨(bian)出(chu)來，我們的實驗(yan)結果(guo)顯(xian)示，不能分辨(bian)大(da)腸桿菌(jun)和葡(pu)萄(tao)球菌(jun)，而較大(da)的黴(mei)菌(jun)可(ke)以(yi)清晰(xi)地分(fen)辨(bian)。
3.2.3 檢測時(shi)間(jian)進壹(yi)步縮短(duan) 細(xi)菌(jun)總(zong)數的經典檢測方(fang)法是平板培(pei)養(yang)法，得到(dao)的結果(guo)精(jing)度(du)高，但是它(ta)所(suo)用(yong)時(shi)間(jian)長，為(wei)了(le)縮短(duan)檢(jian)測時(shi)間(jian)，出(chu)現(xian)了微(wei)菌(jun)落法，將(jiang)檢測時(shi)間(jian)縮短(duan)為(wei)4 h左(zuo)右〔3-5〕。本(ben)研(yan)究不對(dui)細(xi)菌(jun)進行培(pei)養(yang)，而是在(zai)膜(mo)上(shang)染(ran)色後直接用(yong)顯(xian)微(wei)鏡(jing)計數，大(da)限(xian)度地縮短(duan)了(le)檢測時(shi)間(jian)，使整個檢(jian)測時(shi)間(jian)在(zai)1 h左(zuo)右。
4 結論(lun)
本(ben)研(yan)究用(yong)集(ji)菌(jun)儀將(jiang)菌(jun)液過濾後，取濾膜壹(yi)部(bu)分進行染(ran)色、制(zhi)片，然(ran)後在(zai)油(you)鏡(jing)下(xia)統計細(xi)菌(jun)個數。根(gen)據細(xi)菌(jun)在(zai)濾膜上(shang)的分(fen)布(bu)特(te)點(dian)，提出(chu)將(jiang)圓(yuan)形區域作(zuo)為(wei)統計單(dan)位(wei)，得(de)到(dao)圓(yuan)形區域內(nei)細(xi)菌(jun)的平(ping)均個數，從(cong)而(er)計算(suan)出(chu)菌(jun)液濃度(du)。實驗(yan)結果(guo)表(biao)明(ming)，按照該方(fang)法得到的結果(guo)與(yu)平(ping)板培(pei)養(yang)法的結果(guo)無顯(xian)著(zhu)性差異。與(yu)平(ping)板培(pei)養(yang)法和微(wei)菌(jun)落法相(xiang)比，該方(fang)法不需要細(xi)菌(jun)培(pei)養(yang)，檢測時(shi)間(jian)只需要1 h左右，明(ming)顯(xian)縮短(duan)了(le)檢測時(shi)間(jian)，是壹(yi)種快速、有效的細(xi)菌(jun)總(zong)數檢(jian)測方(fang)法。