如(ru)何用(yong)濾(lv)膜法(fa)測細(xi)菌(jun)總數(shu)（集菌(jun)儀(yi)）

 如(ru)何用(yong)濾(lv)膜法(fa)測細(xi)菌(jun)總數(shu)（集菌(jun)儀(yi)）

基(ji)於(yu)濾(lv)膜上細(xi)菌(jun)直(zhi)接(jie)計(ji)數(shu)法(fa)的細(xi)菌(jun)總數(shu)快速檢(jian)測(ce)
【摘(zhai)要(yao)】 細菌(jun)總數(shu)快速檢(jian)測(ce)在(zai)質(zhi)量監(jian)測中(zhong)具有(you)重(zhong)要(yao)的意義，目前除(chu)了(le)經(jing)典(dian)的平(ping)板培養法(fa)以外(wai)，還有(you)微菌(jun)落法(fa)、阻抗(kang)法(fa)等快速檢(jian)測(ce)方法(fa)，這(zhe)些(xie)方法(fa)或(huo)者(zhe)需(xu)要較長的(de)檢(jian)測(ce)時間(jian)，或(huo)者(zhe)需(xu)要較高(gao)的檢(jian)測(ce)成(cheng)本(ben)。本研究提出壹(yi)種(zhong)不需(xu)要培養而在(zai)濾(lv)膜上直(zhi)接(jie)計(ji)數的(de)細菌(jun)總數(shu)的快速檢(jian)測(ce)方法(fa)，它主要分為(wei)過(guo)濾(lv)、染色(se)、顯(xian)微鏡計數(shu)和計(ji)算(suan)四(si)個步驟。計算細(xi)菌(jun)總數(shu)時，根(gen)據細(xi)菌(jun)在(zai)濾(lv)膜上的(de)分(fen)布特點，對(dui)傳(chuan)統(tong)公式進(jin)行改(gai)進(jin)，提出按(an)區(qu)域(yu)計(ji)算細(xi)菌(jun)總數(shu)的計算方法(fa)，提高(gao)了檢(jian)測(ce)精(jing)度(du)。研究結果表明，該(gai)方法(fa)與傳(chuan)統的(de)平(ping)板培養法(fa)無(wu)顯著性(xing)差異(yi)（t=0.847，P=0.436＞0.05），是(shi)壹(yi)種(zhong)低(di)成(cheng)本、快速的細菌(jun)總數(shu)檢(jian)測(ce)方法(fa)。
1 引 言(yan)
細菌(jun)總數(shu)計數的研究已(yi)有(you)很多(duo)，目前國(guo)標(biao)規定的(de)方法(fa)為(wei)平(ping)板計數法(fa)，該(gai)方法(fa)是(shi)將樣(yang)品(pin)加(jia)入瓊脂(zhi)營養基(ji)，在(zai)37 ℃下培養24～48 h後計數(shu)。這(zhe)種(zhong)方法(fa)精(jing)度(du)高(gao)，但(dan)耗(hao)時長(chang)，難以滿足(zu)實(shi)際(ji)工(gong)作(zuo)需(xu)要。為(wei)了(le)簡(jian)化(hua)檢(jian)測(ce)程(cheng)序(xu)、縮(suo)短(duan)檢(jian)測(ce)時間(jian)，國內(nei)外(wai)學者進行了(le)大量的(de)快速檢(jian)測(ce)方法(fa)的研究，提出了阻抗(kang)檢(jian)測(ce)法(fa)〔1〕、Simplate TM全平(ping)器(qi)計數(shu)法(fa)〔2〕、微菌(jun)落技(ji)術〔3-5〕、紙片(pian)法(fa)〔6-7〕等檢(jian)測(ce)方法(fa)，取得(de)了(le)的成果，但(dan)檢(jian)測(ce)時間(jian)仍在(zai)4 h以上。
本(ben)研究在分析了已(yi)有(you)研究成果的基礎(chu)上(shang)，提(ti)出(chu)了在濾(lv)膜上染色(se)後，直接(jie)計數的(de)細菌(jun)總數(shu)檢(jian)測(ce)方法(fa)，具體步驟為(wei)：用(yong)集菌(jun)儀(yi)進(jin)行細(xi)菌(jun)收(shou)集(ji)→在(zai)膜(mo)上進行染色(se)→在(zai)油鏡下計(ji)數(shu)→按(an)公式計(ji)算(suan)出(chu)菌(jun)液濃度(du)。實(shi)驗結果表明，該(gai)方法(fa)與傳(chuan)統的(de)平(ping)板培養法(fa)無(wu)顯著性(xing)差異(yi)，檢(jian)測(ce)時間(jian)約(yue)1 h，是(shi)壹(yi)種(zhong)快速的細菌(jun)總數(shu)檢(jian)測(ce)方法(fa)。
2 材料(liao)與方法(fa)
2.1 材料(liao)
本研究中(zhong)用(yong)的試(shi)驗材(cai)料有(you)集菌(jun)儀(yi)（杭(hang)州(zhou)泰林(lin)生(sheng)物(wu)技(ji)術設備(bei)有(you)限公司(si)），染色(se)劑(ji)，生物顯(xian)微鏡（寧波(bo)永(yong)新光學股(gu)份有(you)限公司(si)），聚(ju)碳(tan)酸(suan)脂(zhi)膜（直(zhi)徑(jing)47 mm）。
2.2 實(shi)驗方法(fa)
2.2.1 準備(bei)工(gong)作(zuo) 卸(xie)下(xia)集(ji)菌(jun)儀(yi)的(de)濾(lv)網（見圖(tu)1），統計濾(lv)網上小孔(kong)總數(shu)，為(wei)計(ji)算(suan)菌(jun)液濃度(du)做(zuo)準備(bei)。另外(wai)，還需(xu)對(dui)集(ji)菌(jun)儀(yi)中(zhong)的集菌(jun)器(qi)進行高(gao)壓滅菌(jun)，以防止(zhi)過(guo)濾(lv)過程中(zhong)引入外(wai)源細菌(jun)。
2.2.2 細(xi)菌(jun)收(shou)集(ji) 取(qu)濃(nong)度(du)的黴菌(jun)菌(jun)液300～500 ml，裝(zhuang)在(zai)集(ji)菌(jun)儀(yi)上(shang)，集(ji)菌(jun)儀(yi)采(cai)用(yong)蠕動(dong)加(jia)壓方式(shi)對(dui)菌(jun)液施加(jia)的壓力(li)，使菌(jun)液流(liu)過(guo)孔(kong)徑(jing)為(wei)0.45 um的(de)聚(ju)碳(tan)酸(suan)脂(zhi)膜。采(cai)用(yong)過濾(lv)方法(fa)是(shi)因(yin)為(wei)它(ta)可(ke)以使細(xi)菌(jun)相(xiang)對(dui)均(jun)勻(yun)地分(fen)布在(zai)濾(lv)膜上，而選(xuan)用(yong)聚碳(tan)酸(suan)脂(zhi)膜是(shi)因(yin)為(wei)這(zhe)種(zhong)膜具有(you)良(liang)好(hao)的(de)透光性(xing)，便(bian)於(yu)用(yong)顯微鏡觀察(cha)。
2.2.3 染色(se) 集(ji)菌(jun)後取下(xia)濾(lv)膜，切下(xia)壹(yi)部分(fen)放在(zai)載玻片(pian)上，進(jin)行染色(se)、固定。染色(se)的(de)目的是(shi)增(zeng)大細(xi)菌(jun)與背(bei)景(jing)的對(dui)比(bi)度(du)，便於(yu)觀察(cha)。
2.2.4 顯(xian)微鏡計數(shu)與計(ji)算 菌(jun)液經(jing)集(ji)菌(jun)儀(yi)過(guo)濾(lv)後，細菌(jun)在(zai)濾(lv)膜上的(de)分(fen)布見(jian)圖(tu)2、圖(tu)3，由圖(tu)可以看(kan)出(chu)細(xi)菌(jun)分(fen)布具有(you)以下兩(liang)個特點：壹(yi)是(shi)細菌(jun)集(ji)中(zhong)在壹(yi)個個的圓(yuan)形(xing)區(qu)域(yu)內(nei)，這(zhe)些(xie)圓(yuan)形(xing)區(qu)域(yu)和擋板的小孔(kong)相對(dui)應；二(er)是(shi)各個圓(yuan)形(xing)區(qu)域(yu)之(zhi)間細(xi)菌(jun)很(hen)少。根據(ju)膜上(shang)細菌(jun)分(fen)布的(de)這(zhe)種(zhong)特點，提(ti)出(chu)以圓(yuan)形(xing)區(qu)域(yu)為(wei)單(dan)位(wei)進(jin)行計(ji)數(shu)，統計(ji)出圓(yuan)形(xing)區(qu)域(yu)內(nei)細菌(jun)的(de)平(ping)均(jun)個數，從(cong)而計(ji)算出菌(jun)液中(zhong)細菌(jun)總數(shu)。具體步驟如(ru)下：隨(sui)機(ji)選(xuan)擇(ze)10個圓(yuan)形(xing)區(qu)域(yu)，在(zai)油鏡下，調(tiao)節(jie)焦(jiao)距以獲(huo)得(de)較清晰的圖(tu)像（見圖(tu)4），統計每(mei)個圓(yuan)形(xing)區(qu)域(yu)內(nei)的細(xi)菌(jun)個數，然(ran)後按(an)公式(1)計(ji)算(suan)出(chu)菌(jun)液的濃(nong)度(du)。
X=A10×N/V(1)圖(tu)2 膜上細(xi)菌(jun)的(de)區(qu)域(yu)分(fen)布
Fig 2 The distributing region of bacteria on the filter(100倍(bei))
圖(tu)3 膜上細(xi)菌(jun)的(de)區(qu)域(yu)間(jian)隔(ge)
Fig 3 The space among the distributing regions(100倍)
圖(tu)4 膜上細(xi)菌(jun)染色(se)後圖(tu)像
Fig 4 Figure of bacteria after coloration(1 000倍)
式(shi)中(zhong)：X表示(shi)待(dai)檢(jian)菌(jun)液濃度(du)（CFU/ml）
A表示(shi)10個圓(yuan)形(xing)區(qu)域(yu)內(nei)細菌(jun)總數(shu)
N表示(shi)濾(lv)網上小孔(kong)總數(shu)
V表示(shi)集(ji)菌(jun)時所用(yong)待檢(jian)菌(jun)液體積（ml）
3 結(jie)果(guo)與討論(lun)
3.1 實(shi)驗結果
按(an)上述方法(fa)計算(suan)得(de)到(dao)的結果與平(ping)板培養法(fa)得(de)到(dao)的結果見(jian)表1。表1 兩(liang)種(zhong)方法(fa)得(de)到(dao)的細菌(jun)總數(shu)
Table 1 Total bacteria number by two different methods
樣本1樣本(ben)2樣(yang)本(ben)3樣(yang)本4樣(yang)本(ben)5樣本6染色(se)鏡檢(jian)
(cfu/ml）185168157165171166平(ping)板培養
(cfu/ml)176155165158183152
對(dui)表1中(zhong)兩(liang)組(zu)數據(ju)進行配(pei)對(dui)t檢(jian)驗(yan)，在(zai)α=0.05時，雙尾(wei)檢(jian)驗(yan)結(jie)果(guo)如(ru)下：t=0.847，P=0.436＞0.05，說(shuo)明兩(liang)種(zhong)方法(fa)得(de)到(dao)的結果無(wu)顯著性(xing)差異(yi)。
3.2 討論(lun)
3.2.1 計(ji)算公式的(de)改(gai)進(jin) 用(yong)集菌(jun)儀(yi)對(dui)樣(yang)本(ben)菌(jun)液進行過(guo)濾(lv)時，由(you)於(yu)濾(lv)網擋板的作用(yong)，使得(de)細(xi)菌(jun)不(bu)是(shi)均勻(yun)地分布在(zai)整個濾(lv)膜上，而是(shi)集中(zhong)分布在(zai)濾(lv)網的小孔(kong)處，所以，計算(suan)細菌(jun)總數(shu)時，不(bu)能采(cai)用(yong)公式X=A40×Φ1Φ22/V（其(qi)中(zhong)Φ1，Φ2分別為(wei)濾(lv)膜直徑(jing)和視(shi)野(ye)直徑(jing)），該(gai)公式是(shi)微菌(jun)落方法(fa)檢(jian)測(ce)細(xi)菌(jun)總數(shu)中(zhong)的常用(yong)計算(suan)公式。在(zai)本(ben)實(shi)驗中(zhong)，根據細菌(jun)分(fen)布的(de)特點，提(ti)出(chu)以圓(yuan)形(xing)區(qu)域(yu)為(wei)單(dan)位(wei)計(ji)算(suan)細菌(jun)總數(shu)的思路，使(shi)計算(suan)結果(guo)更(geng)接(jie)近(jin)真(zhen)實(shi)值，從(cong)而提(ti)高(gao)了檢(jian)測(ce)精(jing)度(du)。
3.2.2 細菌(jun)大小的影響 細(xi)菌(jun)大小對(dui)本(ben)實(shi)驗的影響主要體現(xian)在鏡檢(jian)時，如(ru)果細(xi)菌(jun)太(tai)小，顯微鏡計數(shu)時不(bu)能將(jiang)細(xi)菌(jun)從(cong)背景(jing)中(zhong)分辨出來(lai)，我(wo)們的實(shi)驗結果顯(xian)示(shi)，不(bu)能(neng)分(fen)辨大腸(chang)桿(gan)菌(jun)和葡萄球菌(jun)，而較大的(de)黴菌(jun)可(ke)以清晰地分辨。
3.2.3 檢(jian)測(ce)時間(jian)進壹(yi)步縮(suo)短(duan) 細菌(jun)總數(shu)的經(jing)典(dian)檢(jian)測(ce)方法(fa)是(shi)平(ping)板培養法(fa)，得(de)到(dao)的結果精(jing)度(du)高(gao)，但(dan)是(shi)它所用(yong)時間(jian)長，為(wei)了(le)縮(suo)短(duan)檢(jian)測(ce)時間(jian)，出現(xian)了微菌(jun)落法(fa)，將檢(jian)測(ce)時間(jian)縮(suo)短(duan)為(wei)4 h左右〔3-5〕。本(ben)研究不對(dui)細(xi)菌(jun)進(jin)行培養，而是(shi)在膜(mo)上染色(se)後直接(jie)用(yong)顯微鏡計數(shu)，大限度(du)地縮(suo)短(duan)了檢(jian)測(ce)時間(jian)，使整個檢(jian)測(ce)時間(jian)在1 h左右。
4 結(jie)論(lun)
本(ben)研究用(yong)集菌(jun)儀(yi)將(jiang)菌(jun)液過濾(lv)後，取濾(lv)膜壹(yi)部分(fen)進(jin)行染色(se)、制片(pian)，然(ran)後在油鏡下統(tong)計(ji)細菌(jun)個數。根據(ju)細(xi)菌(jun)在(zai)濾(lv)膜上的(de)分(fen)布特點，提(ti)出(chu)將(jiang)圓(yuan)形(xing)區(qu)域(yu)作(zuo)為(wei)統(tong)計(ji)單(dan)位(wei)，得(de)到(dao)圓(yuan)形(xing)區(qu)域(yu)內(nei)細菌(jun)的(de)平(ping)均(jun)個數，從(cong)而計(ji)算出菌(jun)液濃度(du)。實(shi)驗結果表明，按(an)照該(gai)方法(fa)得(de)到(dao)的結果與平(ping)板培養法(fa)的結(jie)果無(wu)顯著性(xing)差異(yi)。與平(ping)板培養法(fa)和微菌(jun)落法(fa)相比(bi)，該(gai)方法(fa)不需(xu)要細(xi)菌(jun)培養，檢(jian)測(ce)時間(jian)只(zhi)需(xu)要1 h左右，明(ming)顯(xian)縮(suo)短(duan)了檢(jian)測(ce)時間(jian)，是(shi)壹(yi)種(zhong)快速、有(you)效的細(xi)菌(jun)總數(shu)檢(jian)測(ce)方法(fa)。